style="width:0.53294in;height:0.66286in" />附B录 ) 本文是学习GB-T 15805.3-2018 病毒性出血性败血症诊断规程. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了病毒性出血性败血症临床症状、组织病理学特征、病毒分离、中和试验、间接荧光抗体
试验、酶联免疫吸附试验、逆转录聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应进行鉴定的方法。
本标准适用于鱼类病毒性出血性败血症的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
SC/T 7016.1 鱼类细胞系 第1部分：胖头鳞肌肉细胞系(FHM)
SC/T 7016.5 鱼类细胞系 第5部分：鲤上皮瘤细胞系(EPC)
SC/T 7016.9 鱼类细胞系 第9部分：蓝鳃太阳鱼细胞系(BF-2)
SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范
下列缩略语适用于本文件。
BF-2:蓝鳃太阳鱼细胞系(bluegill fry cell line)
bp:碱基对(base pair)
CPE: 细胞病变效应(cytopathic effect)
CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide)
Ct:循环阈值(cycle threshold)
cDNA: 互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid)
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
DEPC: 焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)
dNTP: 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)
EDTA: 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)
EPC: 鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line)
FBS: 胎牛血清(fetal bovine serum)
FHM: 胖头 肌肉细胞系(fathead monnow cell line)
FITC: 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)
HEPES:4- 羟乙基哌嗪乙磺酸[4-
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid]
OPD: 邻苯二胺(o-phenylenediamine)
PBS: 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution)
PBST: 磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffer solution-tween-20)
GB/T 15805.3—2018
PFU: 空斑形成单位(plaque forming unit)
RT-PCR: 逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain
reaction)
RNA: 核糖核酸(ribonucleic acid)
TBE: 三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液(Tris-Borate-EDTA)
TCIDso:50% 组织细胞感染量(50% tissue culture infective dose)
TMB:3,3',5,5'- 四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
VHSV: 病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus)
4.1 水：应符合GB6682 中一级水的规格，用于 RT-PCR 时要用DEPC 处理，除去
RNA 酶。
4.4 逆转录酶-20℃保存，避免温度剧烈变化。
4.5 RNA 酶抑制剂-20℃保存，避免温度剧烈变化。
4.6 dNTP: 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各10 mmol/L。
4.7 Taq 酶： -20 ℃保存，避免温度剧烈变化。
4.9 VHSV 参考株：由农业部相关部门提供。
4.10 鼠抗 VHSV 的单克隆抗体(包被用):由农业部相关部门提供。
4.11 抗 VHSV
的参考血清：与包被用单抗不是来源于同一种动物，由农业部相关部门提供。
4.12 FITC 标记的二抗：抗4.11中所指动物的抗体。
4.13 辣根过氧化物酶标记的二抗：抗4.11中所指动物抗体。
4.14 阴性对照：正常细胞组织悬液。
4.15 鲤鱼上 皮瘤细胞 (EPC)、 蓝鳃太阳鱼细胞 (BF-2)、
胖头鐵肌肉细胞 (FHM) 应分别符合
SC/T 7016.5、SC/T 7016.9 和 SC/T 7016.1 的要求。
4.16 细胞生长液：用含厄尔平衡盐(Earle's balanced salts)的 M199
培养基配置，另加10%胎牛血清 (FBS)。
4.17 细胞维持液：用含厄尔平衡盐(Earle's balanced salts)的 M199
培养基配置，另加2%胎牛血清 (FBS)。
4.19 无水乙醇：分析纯，使用前预冷到-20℃。
4.20 0.01 mol/L PBS:见附录 A 中的 A.1。
4.24 底 物 OPD 溶液：见 A.5。
4.25 CATB 溶液：见 A.6。
4.29 TBE 缓冲液：见 A.9。
GB/T 15805.3—2018
F:5'-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGTGAA-GCG-3',
R:5'-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3',
扩增N 基因的505 bp 片段，序列参见附录B。
F:5'-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3',
R:5'-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3',
探针：5'-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1-3'。
扩增N 基因的532-608的片段，序列参见附录B。
5.11 PCR 仪及荧光定量 PCR 仪。
参见附录C。
鲑、鳟等易感鱼类。
GB/T 15805.3—2018
应在水温低于18℃进行，采样数量应符合 SC/T 7103 的要求。
按 GB/T18088 的规定执行。成熟雌鱼需取卵巢液，鱼卵则取卵膜。体长小于4
cm 的鱼苗取整 条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长4 cm～6cm
的鱼苗取内脏(包括肾);体长大于6 cm 的鱼则
取肾、脾、心和脑组织。
VHSV
的分离，每5尾鱼为1个样品，若有症状成鱼每1尾为1个样品。将所取的样品进行组织研
磨，随后按1:10的比例将研磨好的组织样悬浮于含有1000 IU/mL
青霉素和1000μg/mL 链霉素的 培养液中，于25℃下悬浮2 h～4h
或4℃下孵育过夜。7000 r/min 离心15 min, 收集上清液。卵巢液
不必匀浆，稀释2倍以上。7000 r/min 离心15
min,并在以后的步骤中直接用其上清液。
采用的细胞系有 BF-2、FHM、EPC。 宜同时采用包括 BF-2
在内的两种细胞来培养分离病毒。把
已按1:10制备的组织匀浆上清液再作二次10倍稀释(稀释液用生长液，维持液均可),即达到1:100和
1:1000,接种到生长24 h 长满细胞(BF-2,FHM,EPC)
单层的细胞板中。每个样品至少接种2孔，每孔
(2 cm²)的单层细胞最多接种100 μL 稀释液。15℃~18℃吸附1 h 后，加入含0.01
mol/L HEPES的
细胞培养液，置于15℃~18℃培养。试验中要有2孔阳性对照(接种VHSV
参考株)和2孔空白对照
(未接种病毒的细胞)。逐日于显微镜下观察致细胞病变效应(CPE), 连续观察7
d。 如果在7 d 内没有
细胞病变出现，则还要用敏感细胞再盲传一次。传代程序如下：将接种上述组织上清液的细胞培养物冻
融收集，7000 r/min,4℃ 离心15
min,离心后取上清接种到同种的长满单层的新鲜细胞中，再培养观察
在空白对照细胞正常，阳性对照出现 CPE
的情况下，样品接种细胞并盲传后均无 CPE 出现，判为
阴性；如有 CPE
出现，为病毒分离阳性，需要立即取病毒悬液用下述任意一种方法进行VHSV
鉴定。
9.1 收集出现CPE 的单层细胞，在4℃下2000 g 离心15 min,去除细胞碎片。
9.2 将含病毒的上清液从10-²系列稀释到10-*。
9.3 每稀释度的病毒液与等体积的抗 VHSV
的参考血清混合，同时另取这些病毒稀释液与等体积的
细胞培养液混合。(中和抗体溶液的效价按50%蚀斑减少单位计算不少于1:2000)。
9.4 同时，取参考毒株作为阳性对照，按照9.3的方法制备混合液。
9.6 将上述混合物分别接种到生长约24 h～48h 的 BF-2
单层细胞上(培养于96孔板中),每稀释度接
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2孔，每孔50μL。
9.7 吸附后0.5 h～1h
后，每孔加入含有10%胎牛血清的细胞培养液50μL,于15℃~18℃下培养。
9.9 结果判定：用Reed-Muench 法计算并比较非中和对照组和中和试验组的 TCIDs
值。若病毒悬液 被抗VHSV 特异性参考血清处理后，CPE
被抑制或被显著推迟，而未被处理的细胞培养液中 CPE 明
显，导致二者病毒滴度相差2个以上，则待测的病毒样品为VHSV 中和试验阳性。
10.1 在 2 cm² 的塑料细胞培养板中或盖玻片上制备单层 BF-2
细胞，通常在22℃孵育24 h 即可达到 80%长满单层细胞。
10.2
当准备好用作感染的单层细胞后，在传入细胞的当天或第2天，直接将10倍稀释的待鉴定的病
毒悬液接种到细胞培养孔。每个待鉴定的样本接种6孔，阳性对照和阴性对照另各取2孔。
10.3 按10.2 同样方法稀释 VHSV
病毒参考株的悬液，使得其细胞培养液中病毒滴度要达到
5000 PFU/mL～10000 PFU/mL。
10.5 孵育结束后，吸出细胞培养液，用0.01 mol/LPBS
漂洗1次，然后用冷的固定液(见 A.2)轻轻漂
洗 1 次 。
10.6 每2 cm² 细胞单层用0.5 mL 固定液固定15 min。
10.7 使单层细胞在空气中干燥至少30 min,立即继续下步实验或置于-20℃保存。
10.8 用 PBST 洗4次。使细胞再水化，最后甩干缓冲液。
10.9 用上述的PBST 把抗 VHSV 的参考血清稀释到工作浓度。
10.10 加入10.9抗血清溶液，每2 cm² 孔加0.25 mL。
将加入抗血清的细胞单层在37℃湿盒内反应
1h, 不要让湿盒里的水蒸发干。用PBST 洗4次。
10.11 将 FITC 标记的二抗稀释到工作浓度，每2cm² 孔加0.25mL。
在37℃下反应1h。 再用PBST
漂洗4次。
10.12 用商品化的封片剂封片，立即观察。
10.13
用荧光显微镜观察，在观察前首先要观察阳性对照和阴性对照。应在阳性和阴性样品中看得到
预期的结果后才能进行其他样品的观察。
10.14
结果判定：在阳性对照出现特异的黄绿色荧光点，阴性对照无黄绿色荧光点或仅有微弱绿色背
景的情况下，待检样品在细胞质上有特异的黄绿色荧光点，判定为阳性；只有微弱的绿色背景，判定为
阴性。
11.1 用包被稀释液(见 A.4) 将纯化的鼠抗 VHSV
单克隆抗体稀释到工作浓度，每孔加0.1 mL。 包
被 ELISA 微量板。在4℃孵育过夜或者37℃反应1.5 h～2 h。
11.3 用5%脱脂奶的PBST(200μL/ 孔)封闭，37℃孵育1 h。 再用PBST 冲洗3次。
11.4 每孔加入100 μL
经2或4倍系列稀释的待检样本、未感染的细胞悬液(阴性对照)、VHSV 病毒
悬液(阳性对照)及 PBST (空白对照),于37℃下和包被好的鼠抗 VHSV
单克隆抗体反应1 h。 再
GB/T 15805.3—2018
PBST 洗3次。
11.5 每孔加0.1 mL 用细胞培养液稀释到工作浓度的抗 VHSV
的纯化参考血清。该抗血清不能和包 被用的单抗来源于相同的的动物。37℃孵育1
h。 再用PBST 洗 3 次 。
11.6 每孔加0.1 mL0.1% 的 H₂O₂ (用双蒸水稀释)。37℃反应15 min
以除掉非特异性的过氧化物 酶。倒出孔内液体，用PBST 洗2次。
11.7 每孔加入0.1 mL
用细胞培养液稀释到工作浓度的辣根过氧化物酶标记的二抗。该二抗应是对
应抗11.5所用的参考血清。37℃反应(1.5 h～2 h)。
11.8 用 PBST 冲洗3次。加入0. 1 mL 底物 OPD 溶液(见 A.5)。
当阳性对照出现明显棕黄色，阴性 对照无色时，立即每孔加入0.2 mL 浓度为2
mol/L 的硫酸终止反应，并立即用酶标仪测量各孔在波长
490 nm 时的光吸收值。此步骤的底物也可选用TMB 溶液，选用TMB
反应产物检测需要测量450 nm 时的光吸收值。
11.9
结果判定：以空白对照的光吸收值调零，再测量各孔的光吸收值。先计算阳性对照和阴性对照的
光吸收值之比(即P/N 值)。如果 P/N≥2.1,
表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的 P/N 值。当P/N≥2.1 时判为
VHSV 阳性。
12.1.1 将病毒分离呈阳性的细胞悬液或出现典型临床症状的研磨组织样本悬液450
μL 加入1.5 mL
的离心管中，同时，设立阳性对照、阴性对照和空白对照。取含有已知VHSV
参考株的细胞悬液或含有 病毒目的片段的非感染性体外转录 RNA
作为阳性对照。取正常细胞悬液作为阴性对照。取等体积的
水代替模板作为空白对照。然后将样品与对照同时加入450μLCTAB 溶液(见 A.6)
用旋涡震荡器将 其混匀，25℃作用2.5 h。
12.1.2 将上步处理好的样品离心管加入600μL
抽提液Ⅱ(酚/三氯甲烷/异戊醇)(见 A.7), 充分混合 不少于30 s。12000 r/min
离心5 min, 取上层水相(约800μL)。 再加入700 μL 抽提液 I (三氯甲烷/
异戊醇)(见 A.8),充分混合不少于30 s。12000 r/min离 心 5 min,
小心取上层水相(约600μL)。 再 加入-20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇(约900μL),
充分混匀后， - 20℃8 h 以上沉淀核酸。
12000 r/min离心30 min, 小心弃去上清，干燥后加入11 μL 经 DEPC
处理过的水，溶解后作为 RT- PCR 模板溶液。
12.1.3 也可以采用等效的商品化的总RNA 提取试剂盒。
12.2.1 cDNA 合成
在20μL 反应体系中，添加以下反应成分至相应浓度：1×RT 缓冲液(pH 8.3 的50
mmol Tris, 75 mmol KCl,10 mmol DTT,3 mmol MgCl₂)、1 mmol dNTP、50
pmol的正向引物、5 U 的逆转录酶和
2μL 模板，置于42℃反应30 min。 也可采用一步法，在一个反应体系完成逆转录和
PCR。
12.2.2 DNA 扩增
在50 μL 反应体系中，添加以下反应成分至相应浓度：1×PCR 缓冲液(50 mmol
KCl,pH 9.0 的 10 mmol Tris/HCl,0.1% Triton X-100)、2.5 mmol MgCl₂ 、200
μmol dNTPs、50 pmol的正向引物和反
向引物、1.5 U 的 DNA 聚合酶、5μLcDNA 产物。加矿物油(如PCR
仪有热盖则无需加矿物油)封液后
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放置于PCR 仪。 PCR 反应条件如下：94℃ 2 min;94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃1min,35
次循环；然 后72℃10 min,最后4℃保温。该步骤所用引物对某些IVb
株可能检测不出来，在这个情况下需要用
荧光RT-PCR 来补充。
用TBE 电泳缓冲液(见A.9)配制1.5%的琼脂糖(含0.5μg/mLEB, 见
A.10)平板。将凝胶放入水 平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面，将6μLPCR
扩增产物和2 μL 电泳样品缓冲液(见 A.11)混匀 后加入样品孔。在电泳时设立
DNA 分子量标准作对照。5 V/cm 电泳，当溴酚蓝到达底部时停止，在
紫外透射仪或凝胶成像仪下观察。
12.4.1 RT-PCR 后阳性对照会出现特异505 bp 的 DNA
片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。
12.4.2 待测样品 RT-PCR 扩增后能在相应505 bp DNA
位置上有带，并经测序验证，结果判定为阳
性。无带或带的大小不是505 bp 的均判为阴性。
同12.1。
在25 μL 实时荧光 RT-PCR 反应体系中添加以下反应成分至相应浓度：10×RT-PCR
buffer 2.5μL、上下游引物0.9μmol/L、探针0.25μmol/L、Taq 酶
1U、逆转录酶0.5 U, 模板10μL,补水到总
体积为25μL,同时按12.1要求设立对照。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体
积进行适当调整，也可采用商业荧光 RT-PCR 一步法试剂盒。
13.3.1 将13 . 2中离心后的PCR 管放入荧光 RT-PCR
检测仪内，记录样本摆放顺序。
13.3.2 循环条件设置：
——第一阶段，反转录50 ℃ 30 min;
—第二阶段，预变性95℃ 15 min;
——第三阶段，94℃ 15 s;60℃ 40 s;72℃ 20s,反应40个循环。
13.3.3 不同的试剂盒可根据试剂盒要求将反应参数作适当调整。
阴性对照无 Ct 值，无扩增曲线。阳性对照的 Ct
值应小于35,并出现典型的扩增曲线，否则，此次
实验视为无效。样本无扩增曲线，或者Ct
值大于35的为阴性；出现典型的扩增曲线后 Ct 值小于或等
于35为阳性。
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易感鱼类在发病条件下出现典型的临床症状，或具有典型的病理学特征，或在病毒分离培养中出现
典型的CPE, 判定为疑似病例。
符合14.1的疑似病例的组织样本直接经 RT-PCR、 荧光 RT-PCR
检测结果均为阳性的；或符合 14.1的疑似病例样本经细胞培养产生典型 CPE
的细胞悬液，采用中和试验、IFAT、ELISA 中 1 项 与 RT-PCR 或荧光RT-PCR
中1项进行检测，2项检测结果均为阳性的，或RT-PCR 和荧光RT-PCR 2项
进行检测结果均为阳性的，判定为确诊病例。
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(规范性附录)
试剂配制
A.1 0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.4)
在1000 mL 双蒸水中按顺序加入以下试剂：Na₂HPO₄1.19 g,NaH₂PO₄0.22
g,NaCl8.5 g,调 pH
为7.2～7.4充分搅拌溶解后，4℃保存。
A.2 固定液
30%丙酮与70%乙醇(体积比)的混合物。
A.3 PBST(pH 7.4)
在1000 mL 双蒸水中按顺序加入以下试剂：NaCl8.0 g,KCl0.2
12H₂O₂ .9g, 调 pH 为7.4后，加入Tween-20 充分搅拌摇匀后，4℃保存。
A.4 包被稀释液(pH 9.6)
在1000 mL 双蒸水中按顺序加入以下试剂：Na2CO₃1.59g,NaHCO₃2.93g,
拌溶解后，4℃保存。
g,KH₂PO₄0.2g,Na₂HPO₄ ·
调 pH 为9.6,充分搅
A.5 底物 OPD 溶液 pH 5.0
先用600 mL0.1 mol/LNa₂HPO₄ 和300 mL0.1
100mL 底物稀释液，往其中溶入80 mg 的邻苯二胺 (OPD),
即可使用(临使用前配制)。
mol/L 柠檬酸混合成底物稀释液。然后取
然后加入80 μL 的 H₂O₂ , 放 5 min 不变色
A.6 CTAB 溶液
CTAB 溶液：按CTAB 2%,NaCl1.4 mol/L,EDTA 20 m mol/L,Tris-HCl 20 m mol/L
pH7.5
配制。用前加巯基乙醇至终浓度为0 .25%(配制时在60 mL 水中顺序加入：8.19 g
NaCl,0.774 g
EDTA,1.21gTris, 约0.25 mL～0.3mL 浓盐酸，使 pH=7.5～8.0, 再加入2 gCTAB,
溶完后最后加水
到100 mL)。
A.7 抽提液Ⅱ
1 mol/L Tris水溶液饱和的酚：三氯甲烷：异戊醇=
25:24:1混合，密闭避光保存。
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A.8 抽提液 I
将三氯甲烷：异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。
A.9 TBE 电泳缓冲液(5倍浓缩液)
在1000 mL 双蒸水中按顺序加入以下试剂：Tris 54g,硼酸27.5 g,EDTA 2.922
g,用 5 mol/L 的
HCl 调 pH 为8.0保存备用。
A.10 EB(Ethidium Bromide,核酸染色剂)
用水配制成5 mg/mL 的浓缩液。用时每10 mL 电泳液或琼脂中加1 μL。
A.11 电泳样品缓冲液
每100 mL 水溶液中含：溴酚蓝0.25 g,蔗糖40 g。
11
注3:字体标方框的是荧光RT-PCR 探针序列。
注2:字体标横线的是荧光RT-PCR 引物序列。
注1:字体标灰色的是RT-PCR 引物序列。
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扩 增VHS 病 毒N 基 因 的 序 列
( 资附料
style="width:0.53294in;height:0.66286in" />附B录 )
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(资料性附录)
病毒性出血性败血症(VHS)
C.1 疾病描述
病毒性出血性败血症(VHS) 是一种由弹状病毒(VHSV)
引起的死亡率极高的疾病。该病最早流行
于欧洲大陆，对欧洲的鲑鱼养殖造成了巨大的损失。研究表明，在沿太平洋和大西洋的北美海岸、英国
周边海域、波罗的海、斯卡格拉克海峡、卡特加特海峡以及日本的周边海域的众多养殖与野生鱼类物种
中都有 VHSV 的存在。该病曾被世界动物卫生组织(OIE)、
亚太水产养殖中心(NACA) 列为必须申报
的疫病，我国农业部公布的"一、二、三类动物疫病病种名录"将其列为二类动物疫病。
C.2 宿主
该病最早主要对养殖虹鳟鱼，养殖大菱鲜，养殖牙鲜，以及几种野生海洋鱼类感染。随着研究的深
入 VHSV 易感宿主种类的数量正在不断增加。
C.3 流行水温
疾病通常发生于温度在4℃~14℃之间。温度高于15℃抑制病毒生长。低温通常会导致疾病大
范围的爆发。病毒在4℃淡水中能够存活28 d～35d,
研究发现在4℃已过滤的淡水中1年内还有感
染性。如果水中添加卵巢液或血液制品，如牛血清等有机物质，病毒能存活更长的时间。在15℃的天
然淡水中，13 d 后99 .9%的病毒失活时间为13 d。 但在海水中病毒4 d
内灭活。其他研究发现，在 15℃海水，10 h 后病毒的传染性减少50%,但40 h
后仍可以恢复。在商用冷冻温度下冰冻的受感染鱼
解冻后不会完全杀灭病毒，但会降低病毒的感染性或病毒滴度效价90%以上。
C.4 临床症状
该病在急性感染期表现出明显的临床症状：发病迅速，死亡率高(鱼苗可达100%)。病鱼嗜睡，皮
肤变黑，眼球突出，贫血(鳃苍白),鳍条基部、鳃、眼睛、皮肤出血，游泳异常(快速窜动、螺旋转动等),腹
腔水肿引起腹部膨胀。肾脏及肝脏有明显的影响。在急性期肾脏成暗红色，肝脏是苍白有斑的，在皮
肤，肌肉和内脏中有出血症状。消化道内没有食物。急性感染期之后，疾病出现亚临床(临床症状不明
显)的慢性症状，此时鱼类不出现明显的外部症状。由于病毒感染脑部，VHS
会出现神经性症状，出现
异常剧烈的游泳行为，例如不断快速窜动和/或螺旋转动等。致命的病毒最初存在于尿液，而肾，脾，脑
及心脏，是病毒最丰富的场所。所有年龄的鱼都易受感染，但幼鱼比成鱼更容易受感染。
C.5 组织病理学
组织病理学结果显示 VHSV
阳性内皮细胞主要存在于血管系统。肾、肝、脾会出现大量的点状坏
死和变性，细胞浆出现空泡、核固缩、核溶解，淋巴细胞浸润。红血球会在骨骼肌肌束和纤维处聚集。
GB/T 15805.3—2018
C.6 病原学
C.6.1 该病毒属于弹状病毒科，鱼类弹状病毒属。病毒粒子呈弹状，直径约70 nm,
长约180 nm, 具 包 膜。内包含一个约11000个核苷酸的单链负股 RNA,
基因编码6个蛋白质(N- 核蛋白，P-磷蛋白，M-
基质蛋白，G- 糖蛋白，NV- 非病毒粒子蛋白，L-和病毒有关的聚合酶蛋白)。
C.6.2 VHSV 包含三个血清亚型：1亚型(包括丹麦的 F1 和 hededam)、2
亚型(包括23/75,DK-5131
和 DK-5276)、3 亚型(包括 DK-5151 和 DK-5422)。
C.6.3 VHSV 目前发现有四个不同的基因型：
基因I
型：几个亚谱系包括欧洲淡水分离株，黑海地区分离株，和一组来自波罗的海、卡特加特海
峡、斯卡格拉克海峡、北海和英吉利海峡的海洋分离株。
基因Ⅱ型：波罗的海海洋分离株。
基因Ⅲ型：北大西洋海(从法兰德斯到挪威海岸)、北海、斯卡格拉克海峡和卡特加特海峡分离株。
基因IV型：北美和日本/韩国分离株(2个亚谱系IVa 和IVb)。
C.6.4
该病的主要传播途径是接触其他被感染的鱼类或受污染的水、污染物等导致的横向传播，也可
以通过食鱼鸟类进行传播。在疾病爆发期间以及刚结束爆发期病毒可以很容易通过细胞培养分离出
来。肾脏和脾脏组织中的病毒滴度最高。对于带毒(临床健康)鱼，VHSV
的检测较难。 BF-2 细胞对
淡水欧洲株高度敏感。但是由于不同病毒株对不同细胞敏感性的差异，在分离病毒时建议采用包括
BF-2 在内的二种不同细胞，以提高检出率。
更多内容 可以 GB-T 15805.3-2018 病毒性出血性败血症诊断规程. 进一步学习